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Agarosegelelektrophorese


Ein Verfahren zur Auftrennung von DNA-Molekülen in einem elektrischen Feld ist die Agarosegelelektrophorese. Agarose, bestehend aus glykosidisch verbundener D-Galaktose und 3,6-Anhydrogalaktose, dient als interne Matrix, in dem DNA-Moleküle in einem elektischen Feld wegen der negativ geladenen Phosphatgruppen im Desoxyribose-Phosphat-Rückrad der DNA zur Anode wandern. Die Wanderungsgeschwindigkeit wird durch verschiedene Faktoren, wie die Molekülgröße, die Konformation der DNA, die Agarosekonzentration und die angelegte Gleichspannung, beeinflußt. Lineare, doppelsträngige DNA-Fragmente bewegen sich im Agarosegel indirekt proportional zum dekadischen Logarithmus ihres Molekulargewichtes. Die bei der Agarosegelelektrophorese eingesetzte Agarosekonzentration ist abhängig von dem DNA-Molekulargewichtsbereich, in dem eine effektive Auftrennung der Fragmente erfolgen soll.

1. Vorbereitung des Gels

  • je nach gewünschter Agarosekonzentration des Gels (0,8 - 2,5%) Agarose in TBE- oder TAE-Puffer aufkochen
  • nach dem Abkühlen auf ca. 50° - 60°C Gel luftblasenfrei in einen vorbereiteten Gelträger mit Kamm gießen
  • nach dem Erstarren des Gels Kamm vorsichtig herausziehen
  • Gelträger in eine Pufferkammer einsetzen und mit Puffer überschichten
  • DNA-Proben mit 20% BPB-Ladungspuffer versetzen und je nach Geltaschengröße 5 - 25 µl in die Geltaschen pipettieren

2. Elektrophorese

Die Dauer der Gelelektrophorese ist abhängig von der verwendeten Gelkammer. Meistens werden 100 bis 150 Volt Spannung angelegt, was bei den meisten Kammern 4-5 V/cm entspricht. Die Stromstärke sollte hierbei unter 100 mA liegen.

3. Färbung und Fotografieren des Gels

Zum Anfärben der DNA-Banden wirde das Gel für 5 - 15 min. in einem Ethidiumbromid-Färbe-Bad getränkt. Dabei kommt es zur Interkalierung des EtBr in die DNA. Anschließend wirde das Gel für 5 - 20 min. gewässert, um überschüssiges EtBr aus dem Gel zu entfernen. Da das in die DNA eingelagerte EtBr unter UV-Licht fluoresziert, wirde das gefärbte Gel auf einen Transilluminator (302 nm) gelegt und mit einer Polaroid-Kamera mit einem Wratten-15-Filter unter Verwendung eines Polaroid-professional 665-Films fotografiert.