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Aufpolymerisieren von "sticky ends" mit dem Klenow-Fragment:

Überhängende 5“-Enden bei doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäuren, wie sie möglicherweise bei Restriktionsspaltungen entstehen, können durch eine Aufpolymerisationsreaktion des N-terminalen Fragmentes der E.coli DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) in Gegenwart eines Überschusses an dNTP zu glatten Enden aufgefüllt werden. Hierdurch wird die Ligation von DNA-Fragmenten ermöglicht, die durch Restriktion mit verschiedenen Enzymen inkompatible Ende erhalten haben. Außerdem können so Restriktionsschnittstellen durch Auffüllen und Religation entfernt werden.

Eine typische Reaktion mit dem Klenow-Fragment sieht wie folgt aus:

10 µl - Ansatz:


Inkubation 30 min. 37°C

Inaktivierung des Enzyms: 10 min. 68°C

Puffer

Klenow-Fragment-Puffer

 

KH2PO4

130 mM

MgCl2

6,5 mM

DTT

1 mM

BSA

32 µg/ml

pH 7,4