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DNA-Spaltung durch Restriktionsendonukleasen:

 

Restriktionsenzyme gehören zu der Gruppe der Endonukleasen und spalten Doppelstrang-Desoxyribonukleinsäuren durch Hydrolyse der Phosphodiesterbindung. Man unterscheidet drei Klassen von Restriktionsenzymen. Meistens werden in der Molekularbiologie nur Typ II-Restriktionsenzyme benutzt. Diese spalten im Gegensatz zu den Enzymen vom Typ I oder III die DNA spezifisch innerhalb der Erkennungssequenz. Für diesen Vorgang benötigen sie kein energiereiches ATP, sondern lediglich Mg2+-Ionen als Cofaktoren . Die Effizienz einer Restriktionsspaltung ist abhängig von den Reaktionsbedingungen. Für jede Restriktionsendonuklease gibt es optimale Inkubationstemperaturen und Reaktionspuffer.

Ein typischer Restriktionsansatz mit einem Volumen von 10 µl sieht folgendermaßen aus:

 

 

Bei einigen Restriktionsenzymen muß darauf geachtet werden, daß die Glycerinkonzentration im Reaktionsansatz unter 5% liegt, damit es nicht zu einem Verlust der Hydrolyseaktivität oder zu unspezifischen Spaltungen kommt. Da die Glycerinkonzentration im Lagerungspuffer der Enzyme meistens 50% beträgt, muß die eingesetzte Enzymmenge weniger als 1/10 des Gesamtvolumens des Restriktionsansatzes betragen.

Bei größeren Spaltungsansätzen werden die eingesetzten Mengen der einzelnen Komponenten vervielfältigt. Die Ansätze werden 60 - 90 min. bei der vom Hersteller angegebenen optimalen Temperatur im Wasserbad inkubiert. Im Anschluß daran erfolgte bei Bedarf eine Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms im Reaktionsansatz (10 min. 65°C) oder eine Trennung des Enzyms von der DNA-Lösung durch eine Reinigung-Methode. Der Restriktionsansatz kann danach für Gelelektrophoresen oder Klonierungen verwendet werden.