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Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden

Das Prinzip der Hybridisierung ist die Anlagerung markierter Oligonukleotide (Sonden) an spezifische DNA-Sequenzen derjenigen DNA-Fragmente, die zuvor auf eine Membran bzw. Filter gebracht/ angeheftet wurden. Später läßt sich die Bindung der Sonden an der DNA durch Auflegen eines Filmes sichtbar machen. Überall dort, wo eine Sonde spezifisch an ssDNA anlagerte, sind auch radioaktive Signale vorhanden, welche durch einen sensitiven Film sichtbar gemacht werden. Zunächst müssen die für das Screening geblotteten Membranen über Nacht bei Hybridisierungstemperatur prähybridisiert werden, um die unspezifischen Bindungsstellen auf der Membran mit Lachssperm-DNA abzusättigen, damit später die Sonden nur an spezifischen DNA-Fragmenten binden. Nach der Prähybridisierung wird der Hybridisierungslösung die denaturierte, radioaktive Sonde zugesetzt, und die Filter werden über Nacht hybridisiert, d.h. während dieser Zeit lagert sich die radioaktiv markierte Sonde an die entsprechenden spezifischen DNA-Bereiche auf der Membran an und bildet analog der Basenpaarungsregel zu den komplementären Basen stabilisierende Wasserstoffbrücken aus.

Nach mind. 12 h Hybridisierung wird die Sonde in der Hybridisierungslösung abgefangen, die Filter bzw. Membranen werden gewaschen (um unspezifisch gebundene Sonden-DNA zu entfernen) Dies geschieht folgendermaßen:

3 mal kurz bei Raumtemperatur mit wenig 2x SSC/SSPE; 0,1%SDS-Waschlösung

15min bei 37°C mit 2x SSC/SSPE; 0,1%SDS-Waschlösung

15min bei Hybridisierungstemperatur mit 1x SSC/SSPE; 0,1%SDS-Waschlösung

Folgend wird solange mit einer verdünnten Waschlösung gewaschen, bis kaum noch radioaktive Sonden in der Waschlösung vorhanden (Kontrolle mit dem Geiger-Müller-Zählrohr) und nur noch spezifische Sonden auf der Membran gebunden sind.

Theoretischer Hintergrund zur Hybridisierungskinetik:

Die Nukleinsäurehybridisierung beruht auf dem zufälligen Zusammentreffen zweier komplementärer Einzelstränge. Die Stabilität der Hybride wird bestimmt vom Schmelzpunkt Tm, der Temperatur, bei der die Hälfte der Hybride einzelsträngig vorliegt. Der wesentliche geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Hybridbildung ist die Nukleationsrate, d.h. die Bildungshäufigkeit der ersten wenigen Basenpaarungen zwischen komplementären Strängen. Anschließend läuft die Reaktion schnell im Reißverschlußverfahren ab. Für diesen ersten geschwindigkeitsbestimmenden Schritt ist die umgebende Temperatur (Hybridisierungstemperatur) von großer Bedeutung.

Als optimale Hybridisierungstemperatur hat sich Thyb.= Tm-25°C erwiesen. Bei dieser Temperatur wird eine maximale Hybridbildung erreicht. Der Tm-Wert läßt sich nach folgender Formel berechnen:

Tm(°C) = 81,5 + 16,6 (log M) + 0,41(%GC) - 500/n - 0,61(%Formamid)

Der Schmelzpunkt Tm ist somit abhängig von der Molarität (M) der monovalenten Kationen, also der Salzkonzentration (hohe Ionenkonzentration stabilisiert die Hybride), dem GC-Gehalt im Hybrid (hoher GC-Gehalt stabilisiert die Hybridisierung), von der Länge (n) der kürzesten Sequenzen im Hybrid, und von der Konzentration an Hybrid-destabilisierenden Agenzien, wie Formamid (Zugabe von Formamid senkt den Tm um ca. 0,61°C pro %-Anteil an Formamid.