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Isolierung genomischer DNA:

 

Genomische DNA läßt sich aus den verschiedensten Quellen gewinnen. Der Isolierung genomischer DNA aus Gewebe, Pflanzen, Hefen und Bakterien liegt eine einheitliche Reinigungsstrategie zugrunde, welche lediglich je nach Species variiert wird. Bei genomischer DNA handelt es sich um hochmolekulare DNA, die durch Scherkräfte in kleinere Bruchstücke zerlegt werden kann. In der Praxis werden solche Präparationen nur sehr vorsichtig gemischt und pipettiert. Man vermeidet auch das Pipettieren durch Kanülen oder Pipettenspitzen mit geringen Durchmessern. Die Fällung mit Ethanol kann die Molekülgröße ebenfalls negativ beeinflussen, so daß genomische DNA, wenn sie größer als 150 kb groß sein soll, häufig nicht präzipitiert wird, sondern durch Dialyse gereinigt oder durch Extraktion mit 2-Butanol ankonzentriert wird. Eukaryotische Zellkulturen sowie Gewebe werden durch Natriumdodecylsulfat (SDS) aufgeschlossen und anschließend mit Proteinase K behandelt.

Essentieller Schritt bei der Isolierung ist der proteolytische Abbau der Zellproteine durch Protease K. Einfache Phenolextraktion der DNA zur Abtrennung sämtlicher Proteine würde in diesem Fall nicht ausreichen. Zudem ist die genomische DNA sehr komplex mit Histonen oder Histon-ähnlichen Proteinen verpackt, deren Struktur durch Phenolisierung nicht vollständig aufgebrochen werden kann. Bei Proteinase K handelt es sich um eine Serinprotease. Das Enzym spaltet peptidische Bindungen X-Y, wobei X eine aromatische, aliphatische oder hydrophobe Aminosäure und Y jede Aminosäure sein kann. Wird Proteinase K im Überschuß und mit langen Inkubationszeiten eingesetzt, so werden die Proteine bis hin zur freien Aminosäure abgebaut. Die optimale Inkubationstemperatur liegt zwischen 55 und 65°C. Das Enzym benötigt für seine optimale Aktivität 0,5% SDS, so daß in vielen Fällen die Inkubation im Proteinase K-haltigen Puffer bereits ausreicht, um die Zellen aufzuschließen.

Soll DNA aus Gewebe gewonnen werden, so wird das Gewebe zunächst in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend pulverisiert, um eine homogene Mischung in dem Lysispuffer zu gewährleisten. Proteinase K wird weder durch zweiwertige Metallionen noch durch chelatisierende Agenzien (EDTA) gehemmt. Man deaktiviert und entfernt sie durch Phenolextraktion. Genomische DNA sollte nur äußerst vorsichtig getrocknet werden, da sie sich sonst nur sehr schlecht löst. Phenolextraktion und anschließende Fällung der DNA resultieren in einer durchschnittlichen Molekülgröße von ca. 100-150 kb. Diese Größe ist zur Erstellung genomischer Banken in Bakteriophage l -Vektoren sowie für Southern-Blot-Analysen ausreichend.