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Koloniehybridisierung Teil I:

Mittels Koloniehybridisierung ist es möglich, spezifische DNA-Sequenzen in situ in Bakterienzellen nachzuweisen. Da durch die direkte Fixierung der durch Lyse der Bakterien freigesetzte DNA an eine Nylonmembran eine Isolierung aus den Zellen nicht notwendig ist, bietet die Koloniehybridisierung die Möglichkeit, eine große Kolonieanzahl in kurzer Zeit auf das Vorhandensein bestimmter DNA-Sequenzen hin zu untersuchen.


Puffer und Lösungen für Koloniehybridisierung

Hexanukleotid-Gemisch (Boehringer Mannheim)

 

Hexanucleotide

62,5 A260 Einheiten/ml

Rinderserumalbumin

2 mg/ml

Tris-HCl

0,5 M

MgCl2

0,1 M

Dithioerythrit

1 mM

pH 7,2

 

dNTP-Markierungsgemisch (Boehringer Mannheim)

dATP

1 mM

dCTP

1 mM

dGTP

1 mM

dTTP

0,65 mM

Dig-dUTP

0,35 mM

pH 7,5

 

Eis/Ethanol-Bad

Eine Mischung aus Eis und Ethanol erreicht eine Temperatur von unter 0°C. Dazu wird Eis in einem Behälter mit soviel Ethanol versetzt, daß es möglich ist, Eppendorf-Hütchen in die flüssige Phase zu stellen. Dieses Bad wird zum schnelleren Abkühlen von hitzedenaturierten DNA-Proben verwendet, um die Renaturierungsrate möglichst gering zu halten.

Lösung A:

NaOH

0,5 M

NaCl

1,5 M

Lösung B:

Tris/HCl pH 7,5 1,0 M

Lösung C:

Tris/HCl pH 7,5

1,0 M

NaCl

1,5 M

Depurinierungslösung

HCl 0,25 M

Denaturierungslösung

NaCl

1,5 M

NaOH

0,5 M

Neutralisierungslösung

Tris

1 M

NaCl

2 M

pH 5,0

 

Transferlösung (20x SSC)

NaCl

3 M

Na3-Citrat

0,3 M

pH 6,7

 

Blockierungs-Stammlösung

Blocking-Reagenz (Boehringer) 10 % (w/v) in Puffer 1

Bei der Herstellung ist darauf zu achten, daß sich das Blocking-Reagenz nur in heißem Puffer 1 vollständig lösen läßt.

(Vor)-Hybridisierungslösung

SSC

5x

Blocking-Reagenz

1 %

N-Lauroylsarcosine-Na-Salz

0,1 % (w/v)

SDS

0,02 % (w/v)

Puffer 1

Maleinsäure

0,1 M

NaCl

0,15 M

pH 7,5

 

Puffer 2

1 % (w/v)Blocking-Reagenz in Puffer 1

Puffer 3

Tris-HCl

0,1 M

NaCl

0,1 M

MgCl2

0,05 M

pH 9,5

 

Puffer 4

Tris-HCl

10 mM

EDTA

1 mM

pH 8,0

 

Antikörper-Konjugatlösung (Anti-Digoxigenin-alkalische Phosphatase-Konjugat)


Polyklonale Schaf-Antidigoxigenin-Fab-Fragmente, gebunden an alkalische Phosphatase. Stamm-lösung (750 U/ml) 1 : 5000 mit Puffer 2 verdünnen.

Färbelösung für den immunologischen Nachweis Digoxigenin-markierter DNA


45 µl NBT* ( Nitroblau-Tetrazolium-Salz in 70%igem Dimethylformamid, 75 mg/ml)

35 µl X-Phosphat* (5-Brom-4-Chlor-Indolylphosphat Toluidin-Salz in Dimethylformamid, 50 mg/ml)

in 10 ml Puffer 3 suspendieren

* von Boehringer Mannheim

 

Waschpuffer A

SSC

2x

SDS

0,1 %

Waschpuffer B

SSC

0,1x

SDS

0,1 %

Weitere benötigte Lösungen

 

EDTA-Lösung 0,2 M, pH 8,0 mit NaOH-Plätzchen einstellen

LiCl-Lösung 4 M

Ethanol 70 % (v/v)

Isopropanol 100 %