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Koloniehybridisierung Teil II:

Mittels Koloniehybridisierung ist es möglich, spezifische DNA-Sequenzen in situ in Bakterienzellen nachzuweisen. Da durch die direkte Fixierung der durch Lyse der Bakterien freigesetzte DNA an eine Nylonmembran eine Isolierung aus den Zellen nicht notwendig ist, bietet die Koloniehybridisierung die Möglichkeit, eine große Kolonieanzahl in kurzer Zeit auf das Vorhandensein bestimmter DNA-Sequenzen hin zu untersuchen.


Digoxigenin-dUTP-Markierung von DNA-Sonden

 

Die als Hybridisierungssonde benutzte doppelsträngige DNA wurde in Anlehnung an die Produktanleitung des "Dig DNA Labeling and Detection Kit" (1993) der Firma Boehringer Mannheim linearisiert, zu Einzelsträngen denaturiert und bei der de-novo Synthese der komplementären Stränge mittels "random Primer", der Klenow DNA-Polymerase und einem Nukleotidmix durch den Einbau von digoxigeninmarkiertem Desoxyuridin-Triphosphat (dUTP) markiert. Das dUTP ist über einen Spacer mit dem Steroid-Hapten Digoxigenin verbunden (Dig-dUTP). Nach Hybridisierung an die Ziel-DNA auf dem Filter wurden die Hybride unter Verwendung eines Antikörper-Konjugats (Anti-Digoxigenin-alkalische-Phosphatase-Konjugat, <Dig>-AP) durch die von der alkalischen Phosphatase katalysierte Umsetzung von 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP oder X-Phosphat) und Nitroblau-Tetrazoliumsalz (NBT) nachgewiesen. Hierbei wird BCIP durch die enzymatische Abspaltung der Phosphatgruppe in das entsprechende Indoxyl überführt, das zu einem Keton tautomerisiert. Unter den Detektionsbedingungen dimerisiert das Keton zu blauem Indigo, wobei H+ freigesetzt wird. Dieses reduziert schließlich das zur Farbverstärkung eingesetzte NBT zum purpurnen Diformazan. Beide Farbstoffe fallen dabei in unmittelbarer Nähe der AP-Moleküle aus und färben die Umgebung der markierten DNA-Sonde dunkelviolett an.


Bakterienkolonielift

 

Bei dem Kolonielift werden die Bakterienzellen auf die Nylonmembran übertragen, die Zellen lysiert und die Gesamt-DNA, einschließlich der eventuell vorhandenen gesuchten DNA-Sequenz, auf der Membran fixiert.

Durchführung:

Vorhybridisierung

 

Der getrocknete Nylon-Filter mit der fixierten DNA wurde zunächst, wie in der Produktanleitung von Boehringer Mannheim angegeben, eine Stunde vorhybridisiert, d.h. in einer Pufferlösung mit Casein (Blockierungsreagenz) inkubiert. Dadurch sollen freie Bindungsstellen auf dem Filter abgesättigt und somit eine unspezifische Bindung der markierten Sonden-DNA verhindert werden.

Durchführung:

Hybridisierung

 

Bei der Hybridisierung lagert sich die mit Digoxigenin markierte DNA an homologe Sequenzen der einzelsträngigen DNA auf dem Nylon-Filter an. Die Hybridisierungsbedingungen werden durch die Salzkonzentration (SSC-Puffer), die Konzentration des Blocking-Reagenz und die Hybridisierungstemperatur bestimmt. Durch eine entsprechende Wahl der Bedingungen lassen sich unspezifische Hybridisierungen erheblich reduzieren.

Durchführung:

Waschen des Hybridisierungsfilters

 

Um ungebundene markierte DNA-Fragmente zu entfernen, wird der Filter mehrmals mit unterschiedlich konzentrierten Salzlösungen gewaschen.

Durchführung:

Immunologischer Nachweis

 

An die markierten DNA-Hybride wird zunächst das Antikörper-Konjugat gebunden. Anschließend wird ungebundenes Konjugat durch einige Waschschritte entfernt. Durch die Zugabe von Färbelösung (X-Phosphat und NBT) kommt es zu einer Farbreaktion, durch die hybridisierende DNA-Fragmente sichtbar werden.

Durchführung: