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Ligation von DNA-Fragmenten mittels T4-Ligase

 

Die T4-DNA-Ligase ist für die Ligation von DNA-Fragmenten besonders geeignet, da sowohl komplementäre "sticky ends" als auch "blunt ends" ligiert werden können. Bei der Ligation eines Vektors mit einer Insert-DNA sollte das molare Verhältnis 1 : 3 betragen. Die Ligation erfolgte ü.N. bei 14°C oder für mindestens 4 Stunden bei Raumtemperatur. Um eine optimale Temperatur für die Ligation der jeweiligen DNA-Fragmente zu erreichen, erfolgte die Inkubation z. T. auch ü.N. in einer mit 30°C warmen Wasser gefüllten Thermoskanne im Kühlschrank (4°C). Hierbei kommt es zu einem langsamen Temperaturabfall von der Ausgangs- zur Umgebungstemperatur im Kühlschrank.

Durchführung:

* Ein typischer 20 µl Ligationsansatz besteht aus folgenden Komponenten:

Inkubation ü.N. bei 14°C oder für 4 h bei RT. Alternativ kann auch ü.N. in einer Thermoskanne im Kühlschrank (Temperaturshift: 30°C - 4°C) inkubiert werden.

Um bei einer anschließenden Transformation des Ligationsansatzes eine hohe Transformationseffizienz zu erreichen, ist es von Vorteil, den Ligationsmix 5-fach mit TE-Puffer zu verdünnen.

Puffer

T4-DNA-Ligase-Puffer

 

Tris-HCl

50 mM

MgCl2

10 mM

ATP

1 mM

DTT

1 mM

Polyethylenglycol-8000

25 % (w/v)

pH 7,6