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PCR:

 

Die Polymerase-Kettenreaktion wird zur starken Amplifikation von definierten DNA-Bereichen benutzt. Das Grundprinzip der PCR ist die enzymatische Duplikation einer DNA-Sequenz. Hierzu benötigt werden zwei Oligonukleotide, die Primer, die jeweils komplementär homolog zu dem (+)-Strang des einen Endes und zu dem (-)-Strang des anderen Endes der zu amplifizierenden DNA-Region sind. Nach Hitze-Denaturierung der DNA können sich die Primer bei der anschließenden Abkühlung des Reaktionsansatzes an die DNA-Matrize anlagern. Eine hitzestabile Polymerase, z.B. Taq-Polymerase, erstellt - ausgehend vom 3´-OH-Ende des Primers - durch Primer-Extension eine Kopie der DNA-Matrize. Die Primer müssen so orientiert sein, daß die Synthesen der DNA-Moleküle aufeinander zulaufen. Nachdem die gewünschte Sequenz synthetisiert ist, werden die Stränge durch Hitzeeinwirkung voneinander getrennt. Durch erneute schnelle Senkung der Temperatur wird eine spezifische Bindung der Primer an die entstandenen DNA-Stücke ermöglicht. Durch Primerverlängerung wird dann wieder eine neue Kopie der Template-DNA erstellt.

Durch dreißig- bis vierzigfaches Wiederholen dieses Zyklus erreicht man eine vieltausendfache Vermehrung des definierten DNA-Bereiches zwischen den Primern.

Die Reaktionsschritte im Einzelnen:

1. Trennung der Doppelstränge der Matrizen-DNA (94°C)

2. Annealing der Primer an homologe Bereiche der Template-DNA
Die optimale Anlagerungstemperatur ist abhängig von der Länge und der Basenzusammensetzung der Primer (40 - 60°C)

3. Primerextension im Temperaturoptimum der Polymerase (72°C) durch Nukleotidveresterung

Zwei zusätzliche Reaktionsschritte werden nur einmal durchgeführt: vor Beginn der Zyklen eine vollständige Denaturierung der DNA bei 94°C und zum Schluß einer PCR-Reaktion eine Phase zur Beendigung aller begonnenen Polymerisationen (72°C).

Für eine PCR sind folgende Substanzen im Reaktionsansatz nötig:

1. Zwei Primer

2. Nukleotid-Mix (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)

3. Thermostabile Polymerase (hier: Taq-Polymerase)

4. PCR-Puffer

5. Template-DNA

Die Taq-Polymerase besitzt die Eigenschaft der "Nicht-Matritzenabhängigen Polymerisationsaktivität", durch die an das 3´-Ende des PCR-Produktes ein Adenin-Nukleotid angehängt wird. Dieses mußte bei der anschließenden Klonierung des amplifizierten DNA-Bereiches berücksichtigt werden (siehe Kapitel 9.2. und 9.3.). Andere hitzestabile DNA-Polymerasen (Vent oder Pfu) zeigen diese Aktivität nicht.

Durchführung:

* Die PCR wurde mit einem Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler 480 durchgeführt.

* Ein typischer 50 µl-PCR-Ansatz kann wie folgt aussehen:

* Auf das Überschichten des PCR-Ansatzes mit Mineralöl zu Vermeidung von Verdunstungsverlusten kann bei Verwendung eines Thermocyclers mit beheizbarem Deckel verzichtet werden.

* PCR-Programm können sehr unterschiedlich gestaltet sein. Hier ein Beispiel:

 

2 min

94°C

     

35 Zyklen:

40 sec.

94°C

 

60 sec.

52°C

 

60 sec

72°C
     
  3 min. 72°C

Puffer

PCR-Puffer

Tris-HCl

67 mM

MgCl2

2 mM

(NH4)2SO4

16 mM

BSA

170 µg/ml

DTT

16 mM

pH 8,8