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Plasmid-Minipräparation:

Von einer Stammplatte werden mit Hilfe einer sterilen Öse einzelne Bakterienkolonien aufgepickt, jeweils in 5ml ampicillinhaltiges (Endkonzentration 0,1mg/ml, in diesem Fall 5µl) LB-Medium in einem sterilen Reagenzglas mit Deckel gegeben und über Nacht bei 37°C und starkem Schütteln (~200rpm) kultiviert. Innerhalb dieser Zeitspanne wachsen die Zellen heran, so daß sie dann für eine Plasmidpräparation verwendet werden können.

Von den Ansätzen der ÜN-Kulturen wird zuerst noch ein Aliquot der jeweiligen Probe auf LB-Amp-Platten ausgestrichen, um neue Kolonien anzuzüchten, für evtl. noch weitere anfallende Plasmidpräparationen (Masterplatten).

Die Plasmidpräparation erfolgt nach dem Prinzip der alkalischen Lyse:

Die ÜN-Kulturen werden kurz auf Eis gestellt. Die Bakterienzellen, die das zu isolierende Plasmid enthalten, werden 5min. bei 3000rpm im Ja20-Rotor abzentrifugiert. Der Überstand wird dekantiert, das Pellet, in dem die transformierten Zellen gesammelt sind, wird mit 60µl Glucosemix GTE (Glucose, Tris und EDTA) resuspendiert und in ein Eppendorfgefäß überführt. Zur Lyse der Bakterienzellen werden 200µl 0,2N NaOH/1%SDS zugesetzt, und 5 min. bei Raumtemperatur inkubiert. Durch die Zugabe von 150µl K-Acetat-Mix wird die Reaktion gestoppt, und die genomische DNA ausgefällt. Die Inkubation verläuft für 5 Minuten auf Eis. Das Gemisch wird 10min bei 13000rpm und 4°C in einer für Eppendorfgefäße geeigneten Zentrifuge beschleunigt, um so die Zellreste, denaturierte Proteine und denaturierte DNA von den Plasmiden zu trennen. Das Pellet, indem sich Zellbestandteile, denaturierte Proteine sowie denaturierte DNA befinden, wird verworfen, der Überstand, der die Plasmide enthält, wird vorsichtig abpipettiert. Anschließend folgt zur weiteren Aufreinigung der Probe eine:

Phenol-Chloroform-Extraktion:

Für eine Phenol-Extraktion wird ungefähr das halbe Volumen, also hier ca. 200µl Phenol zugegeben, kurz geschüttelt und abzentrifugiert (3 Minuten bei 13000rpm). Durch die Zugabe von Phenol ist deutlich eine Phasentrennung zu beobachten, wobei gefällte Proteine eine Interphase bilden. Die die Plasmide enthaltende wässrige Oberphase wird von der darunterliegenden Phenolphase vorsichtig abpipettiert, und mit dem gleichen Volumen Chloroform zugesetzt. Die Chloroform-Extraktion erfolgt ebenso wie die Phenolextraktion. Wieder wird die wässrige Phase von der darunterliegenden Chloroformphase vorsichtig abpipettiert und diese mit 1ml 96% Ethanol (2-3faches Volumen) zur Ausfällung/Präzipitation der Plasmid-DNA versetzt. Daraufhin wird die Lösung für 10 min. auf Eis gesetzt und anschließend 20 min. bei 13000 Upm und 4°C zentrifugiert, um die Plasmid-DNA im Pellet zu konzentrieren. Der Überstand wird abgegossen, das Pellet wird mit 500µl 70%igem Ethanol gewaschen, nochmals kurz zentrifugiert, und dann im Speed-Vac getrocknet. Das getrocknete Pellet (die Plasmid-DNA) wird in 50µl dH2O oder TE-Puffer gelöst, und mit RNase (Endkonzentration von 100µg/ml) behandelt, um die im Pellet enthaltene RNA zu verdauen. (Über Nacht im Kühlschrank (4°C) stehen lassen).

Theoretischer Hintergrund zur Plasmidpräparation:

Die Isolation der Plasmide erfolgt nach der klassischen Methode der alkalischen Lyse. Bei der ersten Zentrifugation werden lediglich die Zellen abzentrifugiert, deren Membran anschließend durch Zugabe von NaOH für Detergenzien wie SDS permeabel gemacht werden (SDS alleine wirkt auch schon lysierend). NaOH denaturiert Proteine und zerstört so die Zellmembran die dann permeabel für Ionen und Detergenzien wird. Gleichzeitig zerstört NaOH die Bakterien-DNA und die Proteine aufgrund des alkalischen pH-Wertes. Das SDS (ionisches Detergenz, amphipatisches Molekül, das ein hydrophiles und ein hydrophobes Ende hat und das in wässriger Lösung Micellen bildet) dringt in Zellen ein und solvatisiert Proteine und DNA, indem es sich um diese anlagert und die Proteine/DNA denaturiert werden. Aufgrund des extrem alkalischen pH- Wertes wird die genomische DNA denaturiert. Die Plasmid-DNA wird von NaOH und dem Detergenz kaum beeinflußt, da sie in der ‘supercoiled’ Form vorliegt, also dicht verknäuelt ist und sich NaOH nicht anlagern kann, und so der Doppelstrang getrennt werden würde. Die RNA wird durch das alkalische Medium fragmentiert (alkalische Hydrolyse der RNA; DNA wird im sauren hydrolysiert).

Ursache dafür ist die 2’-OH-Gruppe der Ribose. Durch baseninduzierte Deprotonierung der 2’-OH-Gruppe erfolgt der nucleophile Angriff des 2’-O auf das benachbarte P-Atom, wodurch das Phosphat-Rückrat aufgebrochen wird. Durch Behandlung mit Kalium-Acetat fallen die Proteine, genomische DNA und Zellreste aufgrund von Salzbildung und Überschreitung des Löslichkeitsproduktes aus. Das Kaliumion bildet mit dem SDS schwerlösliche Komplexe an denen auch die genomische DNA hängt, die Acetationen bilden die Gegenionen zu NaOH, die Plasmid-DNA renaturiert wieder vollständig, sie nimmt wieder ihre ursprüngliche Form an, die genomische DNA hingegen bleibt im denaturierten Zustand. Bei der Zentrifugation befinden sich die Plasmid-DNA, RNA-Fragmente und lösliche Proteine im Überstand. Im Pellet befinden sich die Zellreste, ausgefallenen Proteine und DNA des Bakteriengenoms. Durch die Phenol-Chloroform-Extraktion wird die Plasmid-DNA aufgereinigt. Aufgrund des zugesetzten Phenol bzw. Chloroforms kommt es zu einer Phasentrennung, der unteren Phase, der organischen Phase, liegt eine wässrige Phase auf. Die Phenol-Extraktion dient dazu, die Proteine und genomische, denaturierte, nicht gelöste DNA aus der wässrigen Phase, in der die Plasmide enthalten sind, zu entfernen. Proteine sind besser in organischen Lösungsmitteln löslich als in Wasser, und gehen deshalb bei Zugabe von Phenol in diese Phase über. Ferner verdrängt das Phenol die Hydrathülle von den Proteinen, so daß diese ausfallen. Demnach befinden sich in der oberen Phase die Plasmid-DNA und RNA-Reste. Zwischen den 2 Phasen ist eine weiße Bande zu erkennen, die Interphase. In ihr sind ausgefallene Proteine, Nukleotide, Zellreste,... enthalten. Durch die Chloroformextraktionen werden die restlichen Proteine der wässrigen Phase entzogen und Phenolreste ausgewaschen. Das ist wichtig, da die Phenolreste bei einer Photometerauswertung zur Mengenbestimmung das Ergebnis beeinträchtigen würden. Die Plasmid-DNA wird mit Ethanol ausgefällt. Bei Zugabe von Ethanol zu einer wässrigen Lösung wird die Dielektrizitätskonstante des Wassers gesenkt, der Dipol wird geschwächt, die Dipolwechselwirkungen zwischen z.B. DNA und Wasser lassen nach, so daß die negativ geladene DNA ausfällt. Die zugesetzte RNase verdaut die restliche RNA.