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RNA-Präparation mit Trizol:

Mit Hilfe dieser Methode ist es möglich, RNA zu isolieren, ohne das dabei DNA und Proteine zerstört werden, die anschließend dann getrennt isoliert werden können.

Im Praktikum wurde lediglich die RNA aus adulten Schistosomen isoliert.

Dazu werden die in flüssigem Stickstoff eingefrorenen Würmer (ca.100 Stück bzw. 50 bis 100 mg Gewebe) in 1ml Trizol (phenolhaltig) gebracht und homogenisiert (3x 15sek., in den Pausen kurz auf Eis stellen). Der Homogenisator muß vor der Behandlung mit DEPC-H2O gespült werden, um vorhandene RNAsen zu deaktivieren. Zur eigentlichen RNA-Isolation wird das Homogenisat zuerst einmal 5min. bei Raumtemperatur stehengelassen, damit der Protein-Nuklein-Klompex dissoziieren kann. Daraufhin werden 0,2ml Chloroform pro ml Trizol zugesetzt, gut geschüttelt, 2-3min bei Raumtemperatur stehen gelassen und 15min. bei 11.500rpm (12.000 g) und 4°C zentrifugiert, so daß eine Phasentrennung erzielt wird. Die kleine Menge an Chloroform löst sich im Phenol, verdrängt das Wasser von den Proteinen, so daß diese als Interphase ausfallen. Die DNA bleibt in der Phenol-Chloroformphase, während sich die RNA in der oberen wässrigen Phase ansammelt. Die wässrige Phase wird in ein Eppi überführt, der Rest (Phenolphase mit DNA, Interphase mit Proteinen) wird bis zur weiteren Präparation bei 4°C gelagert. Zum Ausfällen der RNA werden 0,5ml Isopropanol pro ml Trizol zugesetzt, mind. 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert (10min., 11.500g, 4°C). Im entstandenen Pellet ist die RNA enthalten. Der Überstand wird verworfen, und das Pellet mit mindestens 1 ml 75%igem Ethanol gewaschen, 5 Minuten bei 9250 Upm und 4°C zentrifugiert und das Pellet an der Luft getrocknet. Die getrocknete RNA wird in H2ODEPC oder 0,5% SDS resuspendiert. Zur vollständigen Resuspension ist es sinnvoll, die Probe für 10min. bei 55°-60°C zu inkubieren.

Bei der RNA-Präparation ist es wichtig, daß die verwendeten Gefäße steril und RNase-frei sind, und auch immer mit Handschuhen gearbeitet wird, da RNasen (welche die RNA zerschneiden) überall auf der Haut vorhanden sind.