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5“-Dephosphorylierung gespaltener Plasmid-DNA


Die Bakterielle Alkalische Phosphatase (BAP) aus E.coli C90 ist eine Phosphomonoesterase, die 3“- und 5“- Phosphate von DNA und RNA hydrolysiert . Sie ist zur Entfernung von 5“-Phosphaten vor einer Endmarkierung und zur Dephosphorylierung von Vektoren vor einer Insertionsligation geeignet. Da die T4-DNA-Ligase nur 5'-Phosphat-Enden mit 3'-OH-Enden verknüpfen kann, wird durch die Behandlung gespaltener Vektor-DNA mit alkalischer Phosphatase eine Rezirkularisierung des Vektors bei der Ligationsreaktion vermieden, wodurch der Anteil rekombinanter Plasmide im Ligationsansatz steigt.

Durchführung:

  • zu einem pmol 5“-Enden 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) zu einem Volumen von 90 µl zugeben
  • 10 µl BAP zugeben, 7 U/µl in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)
  • 60 min. bei 65°C inkubieren
  • 1 µl 0,5 M EDTA (pH 8.0) zugeben und für 10 min. bei 50°C inkubieren
  • Reinigung der DNA anschließen