Icon klein 2.jpg (16591 Byte)                             www.biologe.de

 

Die aus der Ligation enthaltenen Vektoren sollen in Bakterien eingebracht werden, um so zahlreiche Zellen in einer Kolonie anzuzüchten, die alle das identische Stück Fremd-DNA (à DNA-Klon) in ihrem Vektor-Plasmid enthalten. Diese Übertragung genetischer Information durch blanke DNA in einen Zellstamm bezeichnet man als Transformation.

Transformation nach Nishimura:

100µl Zellen (Lagerung bei -80°C) werden auf Eis aufgetaut, und es werden sofort 5µl des zu transformierenden Plasmids zugesetzt und vermischt. Das Zell-Plasmid-Gemisch wird ca. 15 min. lang bei 4°C inkubiert, damit sich die Plasmid-DNA während dieser Zeit um die Zellen herum anlagern kann. Nun erfolgt die eigentliche Transformation, die hier per Hitzeschock durchgeführt wird. Dazu wird der Reaktionsansatz für 30 sek. in ein 42°C warmes Wasserbad gestellt. Durch diese abrupte Temperaturänderung bricht die Zellwand soweit auf bzw. wird soweit gedehnt, daß die Plasmid-DNA ungehindert eindringen kann. Die Zellen werden auf Eis gestellt (1-2 min.) damit die Zellwand sich erneut zusammenlagern kann. Den transformierten Zellen werden 400 µl an LB-Medium zugesetzt und 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit können die Zellen wieder regenerieren.

Für eine Blau-Weiß-Selektion wird die Lösung auf 3 LB-Amp-X-Gal-IPTG-haltigen Platten (Platten, die LB-Agar, Ampicillin, IPTG und den Farbstoff X-Gal enthalten) mit Hilfe einer sterilen Öse ausgestrichen, bei 37°C über Nacht inkubiert, am nächsten Tag mit Parafilm versiegelt und bis zum weiteren Gebrauch bei 4°C aufbewahrt.

Theoretischer Hintergrund zur Blau-Weiß-Selektion:

Bakterien, welche einen zur Blau-Weiß-Selektion fähigen Vektor enthalten, sind ampicillinresistent, da der Vektor ein ampR-Gen enthält, und besitzen überdies eine funktionsfähige b -Galaktosidase, die sich aus dem Plasmid-kodierten Anteil zusammensetzt. Diese Bakterien bzw. deren funktionstüchtige b -Galaktosidasen setzen X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-b -D-Galaktosid) enzymatisch um und bilden Galaktose und den blauen Farbstoff 5-Bromo-4-Chloro-3-Indol, durch den die Kolonien blau erscheinen. Der Einbau des Fragmentes in die MCS (multiple cloning site, liegt innerhalb eines 5’-Abschnitts des lac Z-Gens) zerstört das Leseraster das lac Z-Gens, es kann keine funktionsfähige b -Galaktosidase mehr gebildet werden, so daß die betreffenden Bakterien-Kolonien in Gegenwart von X-Gal farblos (weiß) bleiben. Das IPTG (Isopropyl-thio-galaktosid) dient als Induktor für die b -Galaktosidase, wird jedoch nicht durch die b -Galaktosidase zersetzt.

Dies bedeutet, daß auf den benutzten Nährböden nur diejenigen Bakterien Kolonien bilden können, welche auch durch die Transformation ein ampR-Gen erhielten. Sind die Zellkolonien durch X-Gal blau gefärbt, ist die b -Galaktosidase noch funktionsfähig, d.h. es wurde bei der Ligation keine Fremd-DNA in den Vektor eingebaut. Sind die Zellkolonien nicht gefärbt, so ist die b -Galaktosidase nicht funktionsfähig, d.h. es wurde Fremd-DNA in den Vektor eingebaut, und dadurch das Gen für die b -Galaktosidase zerstört. Dieses gentechnische Verfahren wird auch als Blau-Weiß-Selektion bezeichnet.